這篇文章主要講的是幾種常用的RNA提取方法。
1、異硫氰酸胍氯化銫超速離心法
原理:使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性,經(jīng)過(guò)起始密度為1.78g/ml的氯化銫介質(zhì),進(jìn)行密度梯度超速離心,RNA沉淀于管底,而DNA與蛋白質(zhì)在上清中。使用這種方法,不但能得到高質(zhì)量的RNA,而且能同時(shí)分離出細胞染色體DNA.
本法對于冷凍時(shí)間長(cháng)、細胞質(zhì)和細胞核不易分離的組織標本以及富含RNA酶的組織細胞(如胰腺)的RNA提取尤其適合。此法提取的RNA的質(zhì)量好和成功率高,已成為提取哺乳動(dòng)物細胞RNA的常規方法。其缺點(diǎn)是操作復雜、流程長(cháng),一次提取的樣品數量有限。
2、鹽酸胍-有機溶劑法
本法有MacDonald 1987年在Strohman報道的方法基礎上改進(jìn)而成的,適用于沒(méi)有超速離心及設備的情況下提取細胞總RNA。它利用鹽酸胍抑制RNA酶,勻漿裂解細胞,有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì),通過(guò)選擇性沉淀RNA分子而去除DNA,提取的RNA質(zhì)量較好,但整個(gè)操作過(guò)程繁雜費時(shí)。
3、氯化鋰-尿素法
本法首先由Auffray報道,利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶,3mol/L LiCl選擇性沉淀RNA。其缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì )存在DNA污染,LiCl沉淀RNA會(huì )丟失一些小分子量的RNA,如5S RNA等。優(yōu)點(diǎn)是快速簡(jiǎn)捷,尤其適用于大量樣品少量組織細胞的RNA提取,其質(zhì)量可以滿(mǎn)足Northern分析,Oligo(dT)提取mRNA,SI核酸酶或RNase保護實(shí)驗等。本法每提取107個(gè)細胞能提取總RNA約10?g。
4、熱酚法
本法主要用于少量細胞樣品RNA提取,其產(chǎn)量不高,但簡(jiǎn)單易行。
5、快速提取法
本法主要用于培養細胞,通過(guò)0.5%SDS裂解細胞,酚抽提去除蛋白質(zhì)和DNA沉淀,快速純化RNA。
6、細胞質(zhì)RNA提取法
本法主要適用于培養細胞,首先去除細胞核,然后用蛋白酶K消化蛋白質(zhì),酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。操作簡(jiǎn)單,同時(shí)能進(jìn)行多個(gè)樣品操作,多數步驟在室溫下進(jìn)行,提取的RNA質(zhì)量較高,可滿(mǎn)足體外無(wú)細胞翻譯系統、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保護實(shí)驗。本法提取的RNA產(chǎn)量一般為30~500?g/107個(gè)細胞。
7、酚-氯化鋰法同時(shí)提取細胞RNA和DNA
本法是在Elion和Warner報道的方法基礎上,有Sandeep等人于1990年改進(jìn)而成。它通過(guò)酚和SDS裂解細胞,變性,解聚蛋白,抑制RNase,并用EDTA保護DNA,最后根據RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度,而分離DNA和RNA。整個(gè)過(guò)程在2小時(shí)內完成。RNA可用于Northern分析,DNA可用于內切酶消化以及Southern雜交實(shí)驗。
8、一步快速熱酚抽提法
基于Shomczynki和Sacchi兩人于1987年報道的RNA快速提取法,美國Promega公司有機地將這些試劑組合成總RNA試劑盒,使操作更為簡(jiǎn)單方便,并突出體現以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1)將已知*強的RNase抑制劑異硫氰酸胍、b-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用,抑制了RNA的降解,增強了對核蛋白復合物的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離進(jìn)入溶液,提高了RNA的提取產(chǎn)量;2)RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)DNA和蛋白質(zhì)的水相,容易被異丙醇沉淀濃縮,對大量或少量組織的細胞RNA提取,均甚合適;3)可在3小時(shí)以?xún)忍幚泶罅繕悠?,省略了氯化銫密度梯度超速離心步驟及其它方法使用的長(cháng)時(shí)間選擇性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但會(huì )導致小RNA(<5.8S)的丟失,而且Li+鹽的殘留還會(huì )抑制DNA的合成反應。